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Nature Communications 14권, 기사 번호: 1775(2023) 이 기사 인용

1892년 접속

15 알트메트릭

측정항목 세부정보

정점 복합체는 말라리아 및 톡소플라스마증을 유발하는 병원균을 포함하는 정점 복합체 기생충의 세포골격 및 분비 기계의 특수 모음입니다. 그 구조와 운동 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 우리는 돌출 및 후퇴 상태에서 정점 복합체의 3D 구조를 시각화하기 위해 저온 FIB 밀링 및 저온 전자 단층 촬영을 사용했습니다. 원추형 섬유의 평균은 극성과 관련 단백질이 섬유를 연결하고 안정화시키는 특이한 9개의 프로토필라멘트 배열을 나타냅니다. 원추형 섬유의 구조나 나선형 원추형 복합체의 구조는 돌출 또는 수축 중에 변하지 않습니다. 따라서 원추형은 강체로 움직이며 이전에 제안된 것처럼 스프링과 같거나 압축되지 않습니다. 대신, 이전에 단단한 것으로 간주되었던 APR(첨단 극고리)이 원추형 돌출 중에 팽창합니다. 우리는 돌출 중에 원추형과 APR을 연결하는 액틴 유사 필라멘트를 식별하여 원뿔형 운동 중 역할을 제안합니다. 또한, 우리의 데이터는 원추형 돌출 중 분비 행위에서 기생충을 포착합니다.

모든 세포내 병원체는 새로운 숙주 세포로 진입해야 합니다. Apicomplexan 기생충은 특수한 세포골격 복합체와 분비 소기관으로 구성된 침입 기계를 사용합니다. 집합적으로, 이 소기관 그룹은 정점 복합체(apical complex)로 알려져 있습니다. 말라리아, 톡소플라스마증, 크립토스포리디움증의 원인 물질을 포함하는 문 Apicomplexa가 명명된 것은 이 구조 때문입니다. Apicomplexan 기생충은 섬모 및 와편모충과 같은 진핵생물 슈퍼문 폐포에 속합니다(보충 그림 1). 정점 복합체는 기생충 운동성과 숙주 세포로의 침입 및 탈출에 필수적입니다. 더욱이, 정점 복합 기능을 방해하는 돌연변이는 정점 복합체 기능을 차단하여 비감염성으로 만듭니다1,2,3,4.

정점 복합체 세포골격 자체는 원뿔형이라고 불리는 특수한 튜불린 섬유의 중앙 나선형 주위에 조직된 일련의 고리로 구성된 ~250nm 길이의 구조(대장균 길이의 ~25%)이며, 그 내부에는 분비 소기관이 조직되어 있습니다. 분비를 준비합니다 (그림 1a). 원추형 섬유는 기생충의 표피하 미세소관을 구성하는 동일한 튜불린 이량체로 구성되어 있지만 폐쇄된 튜브를 형성하지는 않습니다5. 대신, 원추형 섬유는 열린 "C" 모양의 구조5를 형성합니다. 원추형 복합체는 매우 역동적입니다. 기생충이 부착물 및 기타 운동성/침습 인자를 분비함에 따라 돌출하고 수축합니다. 놀랍게도, 정점 복합체는 튜불린과 섬모 관련 단백질9,10,11,12을 모두 포함하고 있기 때문에 진핵생물 섬모에서 진화한 것으로 보입니다. 또한, 원추형 및 특수한 튜불린 구조를 포함한 정점 복합체의 핵심은 정점 복합체 전체와 밀접하게 관련된 자유 생활 유기체15뿐만 아니라 와편모충과 같은 더 먼 관련 폐포에서도 보존됩니다16,17(보충) 그림 1). 따라서 정점 복합체는 고대 구조로 나타나며 분자 구성, 고해상도 구조 및 기능에 대한 기계적 이해는 여전히 대부분 미스터리입니다.

돌출된 상태와 후퇴된 상태를 비교하는 콕시디언 정단 복합체의 구성 요소에 대한 만화 개요. 이 색상 구성표는 원고 전체에 걸쳐 사용됩니다. b 단면 방향으로 극저온 FIB 밀링된 부분적으로 후퇴된 원추형을 통한 단층 촬영 슬라이스는 AAD 링 근처에서 끝나고 인접한 SPMT 사이에 산재된 AAD 투영(보라색 화살표)이 있는 SPMT를 명확하게 보여줍니다. c 돌출된 원추형이 있는 N. caninum 의 재건된 정점 끝 부분의 단층 촬영 조각. 내부 막 복합체(IMC, 청록색 화살촉)의 두 막을 연결하는 밀도를 확인하세요. 기타 라벨 및 색상은 아래를 참조하세요. d 돌출된 원추형에서 정점 복합체의 3D 분할 및 시각화((c)와 다른 단층 촬영). 달리 명시하지 않는 한 원고 전체에 사용되는 레이블 및 색상: AAD(보라색), 무정형 APR 관련 밀도 링 및 투영; 액틴 유사 필라멘트((c)의 마젠타색); APR(빨간색), 정점 극성 고리; CF(주황색) 원추형 섬유, ICMT(밝은 녹색) 원뿔내 미세소관, IMC(청록색) 내부 막 복합체, PCR(노란색) 사전 원뿔형 고리, PM(회색) 원형질막, SPMT(진한 녹색) 표피하 미세소관. e (c)에서와 같이 주석이 달린 철회된 원추형을 가진 밀링된 N. caninum의 재구성된 정점 끝의 단층 촬영 조각. f 후퇴된 원추형((e)와 다른 단층 촬영)의 3D 분할 및 시각화 및 (d)와 같이 색상이 지정됩니다. 세로 보기에서는 달리 명시되지 않는 한 정점 끝이 원고 전체의 이미지 상단을 향합니다. 스케일 바: 100nm(b–e).

1-μm thick; to avoid cell flattening by water surface tension). We then used cryo-FIB milling to generate 150–200 nm-thick lamellae of the vitrified, but otherwise native, parasites (Supplementary Fig. 3). To generate these samples, we used the NC1 strain of Neospora caninum, which is a BSL1 organism closely related to the human pathogen Toxoplasma gondii (Supplementary Fig. 1). The conoid of extracellular parasites protrudes and retracts continuously—with and without host cells present, but just before plunge-freezing, the parasites were either prepared in an intracellular-like buffer37 or incubated with 10 μM calcium ionophore for 10 min. so that the majority of parasites have conoids, preferably in the retracted or protruded states6, respectively, without blocking conoid motility or cellular functions like secretion. The resulting cryo-tomograms reveal well-preserved structural details of the native N. caninum apical complex, including membranes, cytoskeletal assemblies, and organelles (Fig. 1 and Supplementary Movie 1)./p>

0.05)./p>1 μm in length, and likely require a more intricate machinery than simple membrane docking to drive secretion. Intriguingly, depolymerization of actin using cytochalasin D blocks parasite motility and invasion but not host cell attachment and rhoptry secretion65, suggesting actin is not responsible for driving secretion. Recent work identified the apicomplexan Nd proteins that comprise the "apical rosettes", structures best characterized in the ciliate group of Alveolata27. Similar to their role in ciliates, the apicomplexan Nd proteins are essential for rhoptry secretion26, and the rosette structure was recently described using cryo-ET of unmilled parasites51. The Toxoplasma protein Ferlin-2 is also required for rhoptry secretion50, and we and others51 identified a density spiraling around the rhoptries within the conoid that is reminiscent of the published Ferlin-2 immuno-EM staining pattern50. These spiraling filaments may act somewhat like dynamin to squeeze the rhoptries during secretion. Among the Toxoplasma Nd-associated proteins were putative GTPase-related proteins26, suggesting a dynamin-like activity may be present at this site as well./p>

1 μm) layer of ice. It is challenging to determine the apical vs. basal ends of the ice-embedded cells in the cryo-FIB milling instrument. Secondly, during the cryo-FIB milling step, the ice thickness was reduced from more than 1 μm to 150–200 nm, removing more than 80% of the volume. Thus, the probability of placing the lamella exactly in the region of the about 300 nm wide conoid is relatively low compared to accidentally milling the apical complex away during the thinning step. Finally, about 10–15% of lamellae were damaged or surface-contaminated during the transfer step from the milling instrument to the TEM. Future application of fluorescence-guided cryo-FIB milling and autoloader systems for more direct transfer of FIB-milled samples into the TEM could address these issues and increase experiment throughput./p>